彩色透水地坪厂家_植生_生态透水混凝土_生态混凝土护坡_高承载植草地坪-江苏古艺匠建设工程有限公司

【上海精瑞科学仪器有限公司 为 BIAseparations中国 正规授权 售后无忧】一家专业提供HPLC色谱柱、GC色谱柱、SPE前处理小柱和其他实验室常用耗材、配件的公司,同时提供各种进口标准品和各类分析仪器
欢迎咨询：
15901762218 冯女士(微信同号)

QQ：3295336257

今天，我们来看看，在进行核酸优化时，为什么选择整体柱要优于传统的多孔颗粒填充柱？这是mRNAFactory 第6篇文章。先放一个BIA Separations制作的整体柱纯化核酸的原理动画，形象生动，易于理解，这篇文章中许多关键的点，在动画中均有描绘。如果看完动画，没有兴趣，那没必要再看下面的文字，因为文章太长，费时费力

固定相构造差异

装填有多孔介质的色谱柱，固定相由多孔颗粒（porous particle）组成。如果把一个多孔颗?？醋魇乔蛐?，那么球体表面会有许多孔，孔内部有众多溶质分子的结合位点。颗粒的直径称为粒径，孔的直径称为孔径?？帕Ｖ涞目占涑莆?strong>空隙体积。Buffer溶液是无法流穿多孔颗粒介质内部的，他们永远选择颗粒间隙阻力最小的流路。

整体柱（monolith）由一整块高度连通的管道组成，流体在均匀分布的管道里流动。整体柱基质由聚甲基丙烯酸酯组成，管道的平均大小是2um。在整体柱内部，每个管道与其他16个，甚至更多的管道连通。管道的高连通性有助于流体的均匀分布，减少运行压力，实现高流速，低柱压。整体柱整个管道的表面都可以用于结合溶质分子，从而造成固定相拥有很高的结合容量。

=多孔颗粒填充柱和整体柱

传质方式差异

固定相介质构造差异造成色谱内流体模式和溶质传质方式的差异，进而引起溶质分子结合效率和洗脱效率的差异。对于色谱的固定相来说，其动态结合容量（dynamic capacity）取决于生物分子的大小，可接触到的表面积以及生物分子实现传质的方式。

扩散和对流基本概念

生物分子从流动相移动到固定相的过程，称为传质（mass transport）。在流体中，实现溶质传质的方式有2种，一种是扩散（diffusion），一种是对流（convection）。

扩散的驱动力是分子朝着随机方向的热运动，统计学上表现为顺浓度梯度。当物质在空间中的分布存在浓度差时，浓度差就会引起扩散，最终随着时间的推移，物质在空间上的分布更加均匀。

对流是由外力驱动的流体整体运动引起的质量传递，例如，液体水的流动会输送水中溶解的分子或者离子。在色谱中，这种外力是由泵或者重力产生的压力差，压力差会引起介质整体的流动。

这些概念代表是色谱吸收基质的理想状态，实际情况下，固定相配体和溶质之间的吸引作用或者排斥作用起 的主导作用。但是，了解溶质传质的方式对于理解不同介质的性能是非常有必要的。

多孔介质中的扩散传质

一个5000bp 的质粒DNA，其质量是3MDa，而巨无霸蛋白IgM的质量才只有960KD。在色谱环境中，核酸分子要表现得比相同质量的蛋白分子大很多。从统计学上讲，生物分子在空间随机翻转，表现得更像是一个球体，其直径等于最长构象。生物分子在流体中的直径，并不直接和质量相关，而是取决于水合直径（hydrodynamic diameter）。相同质量的分子，线性构象的分子要表现得比球状构象的分子更大，例如线性质粒DNA，线性构象的RNA分子。也就是说，不管是单纯从质量上来说，还是从水合直径上来看，核酸都属于超级大分子。

生物分子的大小是非常重要的，因为它决定着扩散速率。扩散是分子从高浓度区域向浓度低区域的随机热运动，非常缓慢，而且随着分子变大，扩散会变得更慢。举例说明，1.2kb RNA分子，其质量是400KD，分子大小是107nm，而IgG蛋白分子量是155KD，其分子大小是11.5nm。1.2kb RNA分子扩散系数要比IgG蛋白慢10倍多，打个比方，IgG从大拇指指甲盖的中心扩散到最边缘需要超过1年的时间，那么107nm RNA分子需要超过10年的时间。

107nm ssRNA 分子和11.5nm IgG 扩散系数比较

在色谱中，固定相和流动相之间的距离非常小，纳米级到微米级，但是对于依靠扩散的方式来实现生物分子传质过程的多孔介质来说，这样的距离是非常大的。在装填多孔颗粒的色谱柱中，扩散是溶质分子进出颗?？拙赌诓康?方式（因为孔径内部的流速为0），溶质分子越大，扩散就越慢，那么固定相多孔介质的动态结合容量就越低。

此外，在多孔颗粒色谱中，对流传质和扩散传质的相互作用也会造成固定相介质结合容量的降低。在对流将生物大分子冲走之前，它有一个非常短的时间扩散进入多孔颗粒内部。流速越快，窗口时间就会越短，溶质来不及扩散进入颗?？拙赌诓?，就已经通过对流冲走了，因此颗粒的结合容量就会越低。由于生物大分子扩散系数降低引起的色谱固相介质结合容量的降低，可通过降低流速来弥补。总结来说，在多孔颗粒介质中，固定相结合容量跟流速和溶质大小成反比。

在多孔颗粒中发生异质性传质，如果流速太快，缓慢的扩散过程无法实现溶质分子在颗?？拙赌诓亢涂帕？障吨涞呐ǘ绕胶?。

整体柱中的对流传质

溶质在整体柱中的流动是连续的，其传质方式只依靠对流传质（convective mass transport）。与此形成对比的是，溶质在多孔介质中的流动是不连续的，通过扩散进出颗?？拙赌谕猓帕Ｖ涞牧鞫嵌粤?。在整体柱中，所有的溶质分子随移动相流动，与其溶质分子本身的大小无关，就像是不同大小的物体随河流移动一样，因此固定相动态结合容量与其流速大小无关。

流速对于固定相介质动态结合容量的影响。左图：由于流速增加，扩散传质效率降低，多孔介质的结合容量随着流速的增加而降低。右图：整体柱中是对流传质，其固相介质结合容量不受流速影响。注：此处的曲线称为Breakthrough Curve，纵坐标指的是由于过载而损失的蛋白占总蛋白的含量，横坐标指的是每ml基质装载的蛋白量（mg protein load/medium volume(mg/ml)）

固相介质孔径和结合表面积差异

大分子物质，比如核酸，在整体柱中拥有更高的结合容量，这也同整体柱为生物大分子提供了一个更大的结合表面积有关。对于整体柱来说，内部管道的整个表面积都是可以被溶质分子结合的。

在多孔介质色谱柱中，溶质分子可以毫无障碍地接触到颗粒外部全部的表面积，但是外部表面积只占到颗?？拙赌诓勘砻婊?%。只有更大的颗?？拙恫拍苋菽筛蟮娜苤史肿樱?，溶质分子要毫无限制地结合到颗?？拙赌诓勘砻?，需要颗粒的平均孔径超过溶质分子十倍之多。多孔介质的孔径超过100nm是非常罕见的，因为孔径过大会降低颗粒稳定性。

溶质大小和颗?？拙洞笮⊙现赜跋旖橹式岷夏芰?

1998年，有人用共聚焦显微镜观察到质粒DNA主要吸附在颗粒的外表面,无法进入颗粒内部 。多孔介质对于蛋白来说，具有更高的结合能力，因为蛋白可以进入颗?？拙赌诓浚季菘拙赌诒砻?。在蛋白和核酸混合物中，这意味着蛋白会优先占据颗粒孔径内部空间。尽管这样会把颗粒外部大量的表面积留给核酸大分子，但不幸的是，颗粒外表面积只占据整个可结合表面积极其小的一部分，对于介质结合容量的改善微乎其微。

质粒DNA吸附在介质表面

在整体柱中，不管大小，所有的溶质分子均有同等的机会结合到开放管道内表面上。这样会造成占据单位表面积的小分子溶质结合质量远远小于占据相同表面积的大分子溶质结合质量。因此对于整体柱来说，大分子溶质会产生更高的结合容量。相反，多孔介质无法从这样的关系中获益，因为大分子低下的扩散系数会限制其实现单位表面积的饱和占据。

溶质分子大小对于介质结合容量的影响

因此，从颗?？拙逗徒橹实ノ幻婊慕岷现柿坷纯?，整体柱更适合大分子溶质，因为其可以提供更高的介质结合容量。而对于小分子（蛋白）来说，多孔介质具有更高效的结合能力。

不同大小的溶质分子在整体柱和多孔介质中的结合容量差异

固相介质弥散差异

简单来说弥散（dispersion）是由于流体速度差异造成的。当流体流过管道时，由于摩擦力的存在